Ejemplo de Terapia Epigenómica

Terapia epigenómica para remodelar el epigenoma 3D en cáncer de mama resistente a terapia endocrina

Tema del artículo: El estudio investiga el uso de terapia epigenómica con decitabina para remodelar la organización tridimensional del ADN en cáncer de mama resistente a terapia endocrina (ER+).
Mecanismo epigenómico tratado: El artículo se enfoca en la tridimensionalidad del ADN y la metilación del ADN. La hipermetilación en células resistentes altera la estructura 3D del genoma, afectando la regulación de genes clave en la respuesta hormonal.

¿Cómo se realizó?:

• Epifármaco: Decitabina (5-Aza-mC), un agente hipometilante aprobado por la FDA.
  
• Métodos: Se utilizaron modelos de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama ER+ resistente. Se analizaron cambios epigenéticos y estructurales con técnicas avanzadas:
• Hi-C y PCHi-C para estudiar la arquitectura tridimensional del genoma.
• WGBS para evaluar la hipometilación global del ADN.
• ChIP-seq y CUT&RUN para analizar interacciones potenciador-promotor y la unión de factores de transcripción como el receptor de estrógeno (ER).

Resultados: 1. La decitabina indujo hipometilación y reconfiguración del epigenoma 3D, activando enhancers asociados al receptor de estrógeno. 2. Se observaron nuevas interacciones entre potenciadores y promotores, lo que aumentó la expresión de genes clave en la regulación hormonal. 3. El tratamiento redujo el crecimiento tumoral, pero al suspenderlo, algunos efectos fueron parcialmente revertidos, indicando que la metilación del ADN es dinámica y recuperable.

UC CHRISTUS. Cáncer de Mama: tratamientos disponibles | UC CHRISTUS [Internet]. YouTube. 2021. Disponible en: https://www.youtube.com/watch?v=qln3H1yuEz4

Referencia bibilográfica:

1. Achinger-Kawecka J, Stirzaker C, Portman N, Campbell E, Chia KM, Du Q, et al. The potential of epigenetic therapy to target the 3D epigenome in endocrine-resistant breast cancer. Nature Structural & Molecular Biology [Internet]. 5 de enero de 2024;31(3):498-512. Disponible en: https://www.nature.com/articles/s41594-023-01181-7

Ejemplo de Técnicas de Edición de Ácidos Nucléicos

Tema: Inserción de la mutación protectora A673T en el gen APP mediante edición de bases CRISPR-Cas9 para reducir β-amiloide en Alzheimer.
Tipo de edición: Ex vivo, somática. Se editan células neuronales derivadas de pacientes para modificar el gen APP y reducir la producción de péptidos β-amiloides.
Dirigido hacia: Mutación A673T en el gen APP, disminuyendo la escisión del precursor amiloide y reduciendo la acumulación de placas β-amiloides.
Dirigido por: CRISPR-Cas9 Base Editor (Cas9n + APOBEC1/Target-AID), convirtiendo citosina en timina sin romper la doble hebra.
Órgano a tratar: Cerebro, específicamente neuronas editadas ex vivo antes de un posible trasplante.
Vía de administración: Ex vivo; se aíslan células, se editan con vectores virales o electroporación y se evalúan antes de un posible reimplante intracerebral o intratecal.
Resultados esperados:

• Corto plazo: (Semanas) Edición eficiente de A673T con hasta 53.3% de conversión y reducción inicial de β-amiloide.
• Mediano plazo: (Meses) Menor formación de placas amiloides en ensayos celulares y modelos animales.
• Largo plazo: (Años) Evaluación preclínica en Alzheimer, con resultados prometedores in vitro e in vivo, pero aún en fase experimental.

Sé Curioso — TED-Ed. ¿Qué es la enfermedad de Alzheimer? - Ivan Seah Yu Jun [Internet]. YouTube. 2015. Disponible en: https://www.youtube.com/watch?v=1VbXBSdGs7U

Referencia bibliográfica:

1. Guyon A, Rousseau J, Bégin FG, Bertin T, Lamothe G, Tremblay JP. Base editing strategy for insertion of the A673T mutation in the APP gene to prevent the development of AD in vitro. Mol Ther Nucleic Acids. 2021;24:253-269. doi:10.1016/j.omtn.2021.02.032.

Terapia Celular con células dendríticas tolerogénicas en esclerosis múltiple

Tema: Terapia celular avanzada para la regulación de la respuesta inmunológica en esclerosis múltiple (EM)

Tipo de célula utilizada: Células dendríticas tolerogénicas (CDtol), una subpoblación de células presentadoras de antígenos diseñada para inducir tolerancia específica frente a proteínas de mielina, inhibiendo la respuesta inflamatoria.

Método de obtención: Las células mononucleares autólogas, extraídas por aféresis, se diferencian in vitro en células dendríticas mediante la exposición a GM-CSF e IL-4. Estas células son luego tratadas con vitamina D3, lo que disminuye la expresión de moléculas coestimuladoras (CD80, CD86) y favorece un fenotipo tolerogénico. Finalmente, se cargan con epítopos de autoantígenos clave, como la proteína básica de la mielina (MBP), la proteína proteolipídica (PLP) y la glicoproteína oligodendrocitaria de la mielina (MOG).

Vía de administración: La terapia se administra a través de inyecciones intraganglionares en los ganglios linfáticos cervicales profundos. Esta estrategia busca una presentación antigénica controlada en un entorno que favorece la expansión de linfocitos T reguladores (Tregs), los cuales modulan la respuesta inmune patológica en el sistema nervioso central (SNC).

Resultados:

• Corto plazo: Los estudios fase I han demostrado seguridad y buena tolerancia, sin efectos adversos graves. Se ha observado una disminución significativa en la producción de citoquinas inflamatorias (TNF-α, IFN-γ) y un incremento en la secreción de IL-10, lo que sugiere una reducción de la actividad inflamatoria.
• Mediano plazo: Se han reportado mejoras en los marcadores de inflamación, con menor proliferación de linfocitos T específicos contra los antígenos de mielina. Las imágenes por resonancia magnética muestran una reducción en la formación de nuevas lesiones desmielinizantes. Los pacientes experimentaron menos brotes y mayor estabilidad en la escala EDSS (Expanded Disability Status Scale).
• Largo plazo: Hasta 2023, los ensayos han demostrado una disminución sostenida de la tasa anualizada de brotes (TAB) y una estabilización clínica en pacientes tratados. Aunque los resultados son prometedores, no se ha logrado una regeneración axonal o remielinización significativa. Las investigaciones actuales exploran el potencial de combinar la terapia con agentes neuroprotectores, como el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), para mejorar la recuperación neuronal. 

Figura 1. Mecanismos neuropatogénicos de la EM (figura modificada de Thompson et al. 2018). Obtenido de: https://hdl.handle.net/10803/688396

Referencia bibliográfica:

1. True, Cristina RTM, María MCE, Dávalos A. Terapia personalizada con células dendríticas tolerogénicas en pacientes con esclerosis múltiple. Ensayo clínico fase i (TOLERVIT-MS) [Internet]. 2022. Disponible en: https://hdl.handle.net/10803/688396

Animales transgénicos y su uso en la medicina; Ventajas y desventajas de los productos transgénicos.

Animales transgénicos y su uso en la medicina.

• TEMA:"Generación y caracterización de cerdos modificados genéticamente con knockout de GGTA1/β4GalNT2/CMAH y expresión humana de CD55/CD47 para estudios de xenotransfusión".
• TIPO DE ANIMAL TRANSGÉNICO: Cerdos (Sus scrofa domestica) modificados genéticamente con técnicas de knockout y knock-in de múltiples genes.
• ¿CÓMO FUE OBTENIDO?
• Knockout (KO): Se eliminaron los genes GGTA1, CMAH, y β4GalNT2, responsables de la producción de azúcares inmunogénicos que provocan rechazo hiperagudo en transfusiones y trasplantes. Este "triple knockout" reduce la respuesta inmunitaria mediante la eliminación de los epítopos antigénicos αGal, Neu5Gc y Sd(a).
• Knock-in (KI): Se insertaron los genes humanos hCD47 y hCD55 bajo el control de promotores específicos para eritrocitos. hCD47 evita la fagocitosis al enviar una señal de "no me comas" a los macrófagos. hCD55 bloquea la activación del sistema de complemento, protegiendo los glóbulos rojos modificados.
• Línea celular PROSA26: Se utilizó la línea de fibroblastos fetales porcinos PROSA26 para las modificaciones genéticas. Las células modificadas se clonaron mediante transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) y se implantaron en cerdas receptoras, generando cerdos transgénicos. 
• ¿PARA QUÉ FUE OBTENIDO? Los cerdos modificados se desarrollaron con el fin de mejorar la compatibilidad inmunológica en procedimientos médicos como la xenotransfusión.
• Resultados en glóbulos rojos (RBCs): Los glóbulos rojos modificados presentaron una reducción significativa en la unión de anticuerpos humanos: Unión de IgG: 99.50% en RBCs de cerdos normales vs. 1.59% en RBCs modificados. Unión de IgM: 99.30% en RBCs normales vs. 12.23% en RBCs modificados.
• Impacto clínico: Los RBCs modificados lograron prolongar su tiempo de circulación, lo que indica un menor riesgo de rechazo inmunológico. Esta mejora es prometedora para pacientes con necesidad de transfusiones frecuentes o emergencias médicas, así como para futuras aplicaciones en xenotrasplante de órganos.

Figura 1. Análisis de citometría de flujo de la expresión de hCD47 y hCD55 en glóbulos rojos y plaquetas de cerdos TKO/ hCD47 / hCD55 . Disponible en: https://doi.org/10.1038/s41598-024-81730-2

Ventajas de los transgénicos:

1. Mejora del perfil nutricional: Algunos transgénicos, como el arroz dorado, son enriquecidos con nutrientes esenciales (ej., vitamina A), lo que ayuda a reducir deficiencias nutricionales severas en poblaciones vulnerables​.
2. Producción biotecnológica de fármacos: Los organismos modificados genéticamente permiten la fabricación de medicamentos como insulina recombinante y anticuerpos monoclonales, mejorando el tratamiento de enfermedades como la diabetes y el cáncer.​
3. Resistencia a plagas y reducción de plaguicidas: Las plantas transgénicas generan toxinas específicas, como la proteína Bt, que actúa contra insectos plaga, disminuyendo la necesidad de plaguicidas químicos​.
4. Aplicación en biorremediación: Bacterias transgénicas especializadas pueden degradar compuestos tóxicos, incluyendo hidrocarburos y metales pesados, contribuyendo a la restauración de ecosistemas contaminados​.
5. Optimización de recursos agrícolas: Al mejorar la eficiencia en el manejo de plagas y enfermedades, los cultivos transgénicos requieren menor uso de insumos, lo que reduce costos y el impacto ambiental​.

Desventajas de los transgénicos:

1. Transferencia de genes a especies no objetivo: La polinización cruzada puede transferir genes modificados a cultivos no transgénicos o plantas silvestres, alterando las dinámicas genéticas naturales y la biodiversidad​.
2. Adaptación evolutiva de plagas: El uso prolongado de cultivos resistentes a plagas genera presión selectiva, favoreciendo la evolución de insectos con resistencia a los mecanismos de defensa transgénicos​.
3. Impactos potenciales en la salud humana: Persisten interrogantes sobre la seguridad a largo plazo de los alimentos transgénicos, incluyendo la posible inducción de reacciones alérgicas o cambios en la regulación epigenética​.
4. Dependencia de herbicidas específicos: Los cultivos resistentes a herbicidas, como el glifosato, han incrementado su aplicación, lo que puede provocar daños ambientales y potenciales riesgos para la salud​.
5. Concentración del mercado biotecnológico: Las patentes de semillas transgénicas están controladas por grandes corporaciones, lo que limita el acceso tecnológico de pequeños productores y genera desigualdades en el mercado agrícola​.

Figura 2. Diferencia de tamaño entre el maíz convencional y transgénico. Disponible en: https://agroavances.com/sabiasque-detalle.php?idSab=787

Referencias bibliográficas:

1. Fang B, Wang C, Yuan Y, Liu X, Shi L, Li L, et al. Generation and characterization of genetically modified pigs with GGTA1/β4GalNT2/CMAH knockout and human CD55/CD47 expression for xenotransfusion studies. Scientific Reports [Internet]. 2 de diciembre de 2024;14(1). Disponible en: https://doi.org/10.1038/s41598-024-81730-2
2. Francisca RF, Desamparados SSM, De València Departamento de Urbanismo - Departament D’Urbanisme UP, De València Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica y del Medio Natural - Escola Tècnica Superior D’Enginyeria Agronòmica I del Medi Natural UP. Seguridad alimentaria de los alimentos transgénicos y el comportamiento del consumidor [Internet]. 2021. Disponible en: https://riunet.upv.es/handle/10251/173469

Ejemplo de ADN recombinante en: diabetes mellitus; y ejemplo de acidos nucléicos recombinantes en la naturaleza: uso de sepiolita para la transferencia de ADN plasmídico.

EJEMPLO 1

Expresión y purificación de insulina humana recombinante a partir de la cepa Escherichia coli 20

Objetivo:

Optimizar la producción de insulina humana recombinante mediante el diseño del vector pIBAINS y el uso de la cepa Escherichia coli 20, garantizando un proceso eficiente y un producto final de alta pureza (99%).

Gen o secuencia a clonar:

Gen híbrido compuesto por;

• L (Líder): Secuencia SOD modificada.
• B: Cadena B de insulina humana.
• X: Conector Lys-Arg.
• A: Cadena A de insulina humana.

Enzimas de restricción: HindIII/SmaI, EcoRI/NdeI y NdeI/XbaI para la construcción del vector pIBAINS.

Enzima ligasa: T4 DNA Ligasa para unir los fragmentos.

Vector: pIBAINS, Incluye el promotor deoP1P2, gen híbrido SOD:INS, gen de resistencia a tetraciclina (Tet) y terminador trpA.

Célula receptora: Escherichia coli 20 IBA 1: Cepa derivada de E. coli K-12 con mutaciones en rpsL (resistencia a estreptomicina) y cytR (facilita expresión).

Mecanismo de transferencia: Transformación bacteriana mediante preparación de células competentes.

Métodos de identificación de clones:

1. Selección en medio con tetraciclina (100 μg/mL).
2. PCR y secuenciación para confirmar la inserción.
3. Análisis de expresión y pureza mediante SDS-PAGE, HPLC y MALDI-TOF/TOF.

Figura 1. Diagrama de bloques del proceso de obtención de insulina humana recombinante a partir de células de E. coli 20. Obtenido de:  https://doi.org/10.1016/j.pep.2019.02.002

EJEMPLO 2

Nanoportadores para transfección de ácidos nucleicos y aplicaciones biotecnológicas

Un ejemplo de ácidos nucleicos recombinantes en la naturaleza se encuentra en el uso de sepiolita para la transferencia de ADN plasmídico en la cepa bacteriana Escherichia coli XL2. Este proceso se realiza mediante el ensamblaje previo del plásmido pUC19 con sepiolita, lo que facilita su introducción en las bacterias sin necesidad de prepararlas como células competentes. La eficiencia de transformación alcanza hasta un millón de transformantes por microgramo de ADN, conservando la estructura y calidad biológica del plásmido, incluidas sus formas superenrolladas. Además, el ADN puede recuperarse adsorbido en la superficie de la sepiolita mediante solución de EDTA, logrando una pureza adecuada para aplicaciones moleculares. Este método es una alternativa económica y eficiente para la transferencia de genes en bacterias.

Figura 2. Imágenes TEM de un conjunto de tres células V79 diferentes incubadas con nanofibras de sepiolita. (A, D y G) con zoom progresivo 2× en las respectivas localizaciones internas de las fibras de sepiolita (10 ng/μL de sepiolita en 5 × 106 células). Las flechas señalan las nanofibras de sepiolita incrustadas en las membranas. Obtenido de: http://scielo.sld.cu/pdf/bta/v34n3/bta05317.pdf 

Referencias bibliográficas:

1. Zieliński M, Romanik-Chruścielewska A, Mikiewicz D, Łukasiewicz N, Sokołowska I, Antosik J, et al. Expression and purification of recombinant human insulin from E. coli 20 strain. Protein Expression And Purification [Internet]. 5 de febrero de 2019;157:63-9. Disponible en: https://doi.org/10.1016/j.pep.2019.02.002
2. Smirnov FAC, López HO-0002-1988-6599 BS, Ragu HO-0001-5088-0155 S, Dardillac HO-0002-9023-8770 E, Hitzky HO-0002-2069-8309 ER, Aranda HO-0003-4383-7698 P, et al. Nanoportadores para transfección de ácidos nucleicos y aplica- ciones biotecnológicas [Internet]. Sld.cu. [citado el 27 de enero de 2025]. Disponible en: http://scielo.sld.cu/pdf/aacc/v12n2/2304-0106-aacc-12-02-e1156.pdf

TÉCNICAS DE PCR EN EL DIAGNÓSTICO DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (VPH)

Tema: PCR-Nested Multiplex (NMPCR) en la identificación y genotipificación del VPH.

Objetivo: Desarrollar y evaluar la PCR-Nested Multiplex (NMPCR) para detectar y diferenciar genotipos de VPH, enfocándose en cepas de alto riesgo asociadas a lesiones cervicales.

Muestra biológica: Células epiteliales extraídas de muestras de citología cervical, biopsias del cuello uterino y exudados vaginales.

Tipo de ADN: ADN viral extraído directamente de células epiteliales infectadas.

Gen o secuencia a amplificar: Región L1 del genoma del VPH, específica para genotipos oncogénicos como VPH-16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 67, 68, 73 y 82.

Tamaño en pares de bases: Aproximadamente 450-650 pb, dependiendo del genotipo.

Tipo de PCR: PCR-Nested Multiplex (NMPCR).

Visualización: Los productos amplificados se analizan mediante electroforesis capilar automatizada, usando sondas fluorescentes específicas para la genotipificación; que permiten detectar los diferentes genotipos de VPH en función de los tamaños de los fragmentos amplificados.

Goulart LR, Colombo BFM, Lima MIS, De Andrade MSA, Julião JS, Neves AF, et al. Schematic representation of the nested-multiplex polymerase chain reaction (NMPCR) for HPV detection and genotyping [imagen en línea]. Microorganisms. 2024;12(1):Article 2326. Disponible en: https://www.mdpi.com/microorganisms/microorganisms-12-02326/article_deploy/html/images/microorganisms-12-02326-g001.png

Método de extracción del ADN:

• Lisis celular con proteinasa K y tampón EDTA-Tris.
• Precipitación con acetato de amonio e isopropanol.
• Purificación con etanol al 70%.

Pasos:

1. Extracción de ADN.
2. Amplificación en dos rondas (PCR externa e interna).
3. Identificación mediante electroforesis capilar.

Amplificación:

• Primera PCR (externa): 40 ciclos, desnaturalización a 94 °C, alineamiento a 50 °C, extensión a 72 °C.
• Segunda PCR (interna): 36 ciclos, desnaturalización a 95 °C, alineamiento a 56 °C, extensión a 72 °C.

Extensión inicial: 72 °C (2 min) en la PCR externa.

Extensión final: 72 °C (40 s) en la PCR interna.

Enzimas utilizadas: No se usaron enzimas de restricción. La identificación de genotipos se realiza mediante electroforesis capilar automatizada, lo que elimina la necesidad de cortar los fragmentos de ADN con enzimas, aumentando la sensibilidad y simplificando el proceso.

Resultados:

• Prevalencia de VPH: 59% en la población estudiada.
• Infecciones múltiples: 58% de las infecciones fueron múltiples.
• Genotipos de alto riesgo: Detectados en el 60% de las infecciones múltiples (VPH-16, 18, 31, 52, etc.).
• Sensibilidad y especificidad: Sensibilidad del 97.5% y especificidad del 100% para lesiones de alto grado (CIN2+ y CIN3+).
• Capacidad de detección: Eficaz incluso en bajas cargas virales (hasta 10−6 ng/µL).

Referencia bibliográfica:

1. Goulart LR, Colombo BFM, Lima MIS, De Andrade MSA, Julião JS, Neves AF, et al. Expanded HPV Genotyping by Single-Tube Nested-Multiplex PCR May Explain HPV-Related Disease Recurrence. Microorganisms [Internet]. 15 de noviembre de 2024;12(11):2326. Citado el 08 de diciembre de 2024. Disponible en: https://doi.org/10.3390/microorganisms12112326

Video informativo (adicional) relevante al tema:

Dra Kerlis Delgado - Ginecóloga. Papanicolau o PCR para detectar VPH - Dra. Kerlis Delgado Ginecóloga [Video]. YouTube. 2023. Disponible en: https://www.youtube.com/watch?v=AXDL5YPOQf0

Alteración en la epigenética: Cáncer colorrectal (CCR)

Gestor de fuentes de búsqueda bibliográfica (Perplexity y Google scholar). Autoría Propia, 2024. 

Las alteraciones epigenéticas en el cáncer colorrectal (CCR), implican dos categorías de mecanismos principales, la metilación anormal del ADN, modificaciones de las histonas y la desregulación del ARN no codificante. Uno de los casos, con mayor relevancia es la hipermetilación de las islas CpG, que impide la expresión de genes supresores de tumores, incluido el MLH1, y contribuye a subtipos como el fenotipo metilador de las islas CpG. Este último se ha asociado con algunas manifestaciones clínicas distintivas, como las mutaciones BRAF y la localización específica en el colon proximal de algunos tumores. Además, la hipometilación global contribuye a la inestabilidad genómica y la activación de protooncogenes. Estos cambios, se vuelven visibles tempranamente acorde a la progresión del CCR y se han propuesto como biomarcadores para su diagnóstico, pronóstico y la predicción de una respuesta terapéutica.

Cáncer de colon o colorrectal. Síntomas, diagnóstico y tratamiento. Clínica Universidad de Navarra [Video]. Youtube; 2024. Disponible en: https://www.youtube.com/watch?v=te_3AHC2530.

Referencias bibliográficas:

1. Gutierrez-Angulo M, De la Luz Ayala-Madrigal M, Moreno-Ortiz JM, Peregrina-Sandoval J, Garcia-Ayala FD. Microbiota composition and its impact on DNA methylation in colorectal cancer. Frontiers In Genetics [Internet]. 8 de agosto de 2023;14. Disponible en: https://doi.org/10.3389/fgene.2023.1037406
2. Sonia-Vanina FF, Perucho M, De Barcelona Facultat de Medicina U. Biomarkers and Combinatorial Drug Targets for a Personalized Therapy in Colorectal Cancer [Internet]. 2022. Disponible en: https://hdl.handle.net/2445/186631
3. Jung G, Hernández-Illán E, Moreira L, Balaguer F, Goel A. Epigenetics of colorectal cancer: biomarker and therapeutic potential. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology [Internet]. 3 de enero de 2020;17(2):111-30. Disponible en: https://www.nature.com/articles/s41575-019-0230-y