TÉCNICAS DE PCR EN EL DIAGNÓSTICO DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (VPH)

Tema: PCR-Nested Multiplex (NMPCR) en la identificación y genotipificación del VPH.

Objetivo: Desarrollar y evaluar la PCR-Nested Multiplex (NMPCR) para detectar y diferenciar genotipos de VPH, enfocándose en cepas de alto riesgo asociadas a lesiones cervicales.

Muestra biológica: Células epiteliales extraídas de muestras de citología cervical, biopsias del cuello uterino y exudados vaginales.

Tipo de ADN: ADN viral extraído directamente de células epiteliales infectadas.

Gen o secuencia a amplificar: Región L1 del genoma del VPH, específica para genotipos oncogénicos como VPH-16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 67, 68, 73 y 82.

Tamaño en pares de bases: Aproximadamente 450-650 pb, dependiendo del genotipo.

Tipo de PCR: PCR-Nested Multiplex (NMPCR).

Visualización: Los productos amplificados se analizan mediante electroforesis capilar automatizada, usando sondas fluorescentes específicas para la genotipificación; que permiten detectar los diferentes genotipos de VPH en función de los tamaños de los fragmentos amplificados.

Goulart LR, Colombo BFM, Lima MIS, De Andrade MSA, Julião JS, Neves AF, et al. Schematic representation of the nested-multiplex polymerase chain reaction (NMPCR) for HPV detection and genotyping [imagen en línea]. Microorganisms. 2024;12(1):Article 2326. Disponible en: https://www.mdpi.com/microorganisms/microorganisms-12-02326/article_deploy/html/images/microorganisms-12-02326-g001.png

Método de extracción del ADN:

• Lisis celular con proteinasa K y tampón EDTA-Tris.
• Precipitación con acetato de amonio e isopropanol.
• Purificación con etanol al 70%.

Pasos:

1. Extracción de ADN.
2. Amplificación en dos rondas (PCR externa e interna).
3. Identificación mediante electroforesis capilar.

Amplificación:

• Primera PCR (externa): 40 ciclos, desnaturalización a 94 °C, alineamiento a 50 °C, extensión a 72 °C.
• Segunda PCR (interna): 36 ciclos, desnaturalización a 95 °C, alineamiento a 56 °C, extensión a 72 °C.

Extensión inicial: 72 °C (2 min) en la PCR externa.

Extensión final: 72 °C (40 s) en la PCR interna.

Enzimas utilizadas: No se usaron enzimas de restricción. La identificación de genotipos se realiza mediante electroforesis capilar automatizada, lo que elimina la necesidad de cortar los fragmentos de ADN con enzimas, aumentando la sensibilidad y simplificando el proceso.

Resultados:

• Prevalencia de VPH: 59% en la población estudiada.
• Infecciones múltiples: 58% de las infecciones fueron múltiples.
• Genotipos de alto riesgo: Detectados en el 60% de las infecciones múltiples (VPH-16, 18, 31, 52, etc.).
• Sensibilidad y especificidad: Sensibilidad del 97.5% y especificidad del 100% para lesiones de alto grado (CIN2+ y CIN3+).
• Capacidad de detección: Eficaz incluso en bajas cargas virales (hasta 10−6 ng/µL).

Referencia bibliográfica:

1. Goulart LR, Colombo BFM, Lima MIS, De Andrade MSA, Julião JS, Neves AF, et al. Expanded HPV Genotyping by Single-Tube Nested-Multiplex PCR May Explain HPV-Related Disease Recurrence. Microorganisms [Internet]. 15 de noviembre de 2024;12(11):2326. Citado el 08 de diciembre de 2024. Disponible en: https://doi.org/10.3390/microorganisms12112326

Video informativo (adicional) relevante al tema:

Dra Kerlis Delgado - Ginecóloga. Papanicolau o PCR para detectar VPH - Dra. Kerlis Delgado Ginecóloga [Video]. YouTube. 2023. Disponible en: https://www.youtube.com/watch?v=AXDL5YPOQf0