Tema: PCR-Nested Multiplex (NMPCR) en la identificación y genotipificación del VPH.
Objetivo: Desarrollar y evaluar la PCR-Nested Multiplex (NMPCR) para detectar y diferenciar genotipos de VPH, enfocándose en cepas de alto riesgo asociadas a lesiones cervicales.
Muestra biológica: Células epiteliales extraídas de muestras de citología cervical, biopsias del cuello uterino y exudados vaginales.
Tipo de ADN: ADN viral extraído directamente de células epiteliales infectadas.
Gen o secuencia a amplificar: Región L1 del genoma del VPH, específica para genotipos oncogénicos como VPH-16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 67, 68, 73 y 82.
Tamaño en pares de bases: Aproximadamente 450-650 pb, dependiendo del genotipo.
Tipo de PCR: PCR-Nested Multiplex (NMPCR).
Visualización: Los productos amplificados se analizan mediante electroforesis capilar automatizada, usando sondas fluorescentes específicas para la genotipificación; que permiten detectar los diferentes genotipos de VPH en función de los tamaños de los fragmentos amplificados.
Método de extracción del ADN:
- Lisis celular con proteinasa K y tampón EDTA-Tris.
- Precipitación con acetato de amonio e isopropanol.
- Purificación con etanol al 70%.
Pasos:
- Extracción de ADN.
- Amplificación en dos rondas (PCR externa e interna).
- Identificación mediante electroforesis capilar.
Amplificación:
- Primera PCR (externa): 40 ciclos, desnaturalización a 94 °C, alineamiento a 50 °C, extensión a 72 °C.
- Segunda PCR (interna): 36 ciclos, desnaturalización a 95 °C, alineamiento a 56 °C, extensión a 72 °C.
Extensión inicial: 72 °C (2 min) en la PCR externa.
Extensión final: 72 °C (40 s) en la PCR interna.
Enzimas utilizadas: No se usaron enzimas de restricción. La identificación de genotipos se realiza mediante electroforesis capilar automatizada, lo que elimina la necesidad de cortar los fragmentos de ADN con enzimas, aumentando la sensibilidad y simplificando el proceso.
Resultados:
- Prevalencia de VPH: 59% en la población estudiada.
- Infecciones múltiples: 58% de las infecciones fueron múltiples.
- Genotipos de alto riesgo: Detectados en el 60% de las infecciones múltiples (VPH-16, 18, 31, 52, etc.).
- Sensibilidad y especificidad: Sensibilidad del 97.5% y especificidad del 100% para lesiones de alto grado (CIN2+ y CIN3+).
- Capacidad de detección: Eficaz incluso en bajas cargas virales (hasta 10−6 ng/µL).
- Goulart LR, Colombo BFM, Lima MIS, De Andrade MSA, Julião JS, Neves AF, et al. Expanded HPV Genotyping by Single-Tube Nested-Multiplex PCR May Explain HPV-Related Disease Recurrence. Microorganisms [Internet]. 15 de noviembre de 2024;12(11):2326. Citado el 08 de diciembre de 2024. Disponible en: https://doi.org/10.3390/microorganisms12112326
