Ejemplo de ADN recombinante en: diabetes mellitus; y ejemplo de acidos nucléicos recombinantes en la naturaleza: uso de sepiolita para la transferencia de ADN plasmídico.

EJEMPLO 1

Expresión y purificación de insulina humana recombinante a partir de la cepa Escherichia coli 20

Objetivo:

Optimizar la producción de insulina humana recombinante mediante el diseño del vector pIBAINS y el uso de la cepa Escherichia coli 20, garantizando un proceso eficiente y un producto final de alta pureza (99%).

Gen o secuencia a clonar:

Gen híbrido compuesto por;

• L (Líder): Secuencia SOD modificada.
• B: Cadena B de insulina humana.
• X: Conector Lys-Arg.
• A: Cadena A de insulina humana.

Enzimas de restricción: HindIII/SmaI, EcoRI/NdeI y NdeI/XbaI para la construcción del vector pIBAINS.

Enzima ligasa: T4 DNA Ligasa para unir los fragmentos.

Vector: pIBAINS, Incluye el promotor deoP1P2, gen híbrido SOD:INS, gen de resistencia a tetraciclina (Tet) y terminador trpA.

Célula receptora: Escherichia coli 20 IBA 1: Cepa derivada de E. coli K-12 con mutaciones en rpsL (resistencia a estreptomicina) y cytR (facilita expresión).

Mecanismo de transferencia: Transformación bacteriana mediante preparación de células competentes.

Métodos de identificación de clones:

1. Selección en medio con tetraciclina (100 μg/mL).
2. PCR y secuenciación para confirmar la inserción.
3. Análisis de expresión y pureza mediante SDS-PAGE, HPLC y MALDI-TOF/TOF.

Figura 1. Diagrama de bloques del proceso de obtención de insulina humana recombinante a partir de células de E. coli 20. Obtenido de:  https://doi.org/10.1016/j.pep.2019.02.002

EJEMPLO 2

Nanoportadores para transfección de ácidos nucleicos y aplicaciones biotecnológicas

Un ejemplo de ácidos nucleicos recombinantes en la naturaleza se encuentra en el uso de sepiolita para la transferencia de ADN plasmídico en la cepa bacteriana Escherichia coli XL2. Este proceso se realiza mediante el ensamblaje previo del plásmido pUC19 con sepiolita, lo que facilita su introducción en las bacterias sin necesidad de prepararlas como células competentes. La eficiencia de transformación alcanza hasta un millón de transformantes por microgramo de ADN, conservando la estructura y calidad biológica del plásmido, incluidas sus formas superenrolladas. Además, el ADN puede recuperarse adsorbido en la superficie de la sepiolita mediante solución de EDTA, logrando una pureza adecuada para aplicaciones moleculares. Este método es una alternativa económica y eficiente para la transferencia de genes en bacterias.

Figura 2. Imágenes TEM de un conjunto de tres células V79 diferentes incubadas con nanofibras de sepiolita. (A, D y G) con zoom progresivo 2× en las respectivas localizaciones internas de las fibras de sepiolita (10 ng/μL de sepiolita en 5 × 106 células). Las flechas señalan las nanofibras de sepiolita incrustadas en las membranas. Obtenido de: http://scielo.sld.cu/pdf/bta/v34n3/bta05317.pdf 

Referencias bibliográficas:

1. Zieliński M, Romanik-Chruścielewska A, Mikiewicz D, Łukasiewicz N, Sokołowska I, Antosik J, et al. Expression and purification of recombinant human insulin from E. coli 20 strain. Protein Expression And Purification [Internet]. 5 de febrero de 2019;157:63-9. Disponible en: https://doi.org/10.1016/j.pep.2019.02.002
2. Smirnov FAC, López HO-0002-1988-6599 BS, Ragu HO-0001-5088-0155 S, Dardillac HO-0002-9023-8770 E, Hitzky HO-0002-2069-8309 ER, Aranda HO-0003-4383-7698 P, et al. Nanoportadores para transfección de ácidos nucleicos y aplica- ciones biotecnológicas [Internet]. Sld.cu. [citado el 27 de enero de 2025]. Disponible en: http://scielo.sld.cu/pdf/aacc/v12n2/2304-0106-aacc-12-02-e1156.pdf